疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立

目的建立灭疟后蚊媒监测的有效方法。方法设计4对疟原虫属、人类血液、中华按蚊和蚊子的通用特异引物，并与通用引物（5’-CGAGTCTGCGGTCTCAA ATT－3’）连接，形成4对嵌合特异引物。常规PCR确定了每对引物的最佳退火温度和引物工作浓度，多重PCR优化了混合四对引物后的最佳反应条件，并引入了模拟风险感染的蚊子样本，建立了灵敏的多重PCR反应体系。检测四名疟疾患者（间日疟、卵形疟疾、恶性疟和三日疟）全血样本中各种基因的扩增，并评估检测灵敏度。使用溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、巴贝斯虫田鼠、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、日本血吸虫尾蚴、卫氏并殖吸虫、蛔虫、牛带绦虫DNA或猪带绦虫等11种其他寄生虫的感染样本来评估该方法的检测特异性。在牲畜围栏周围采集的野生中华按蚊样本用于评估PCR方法的应用效果。结果优化的多重PCR反应体系中各组分的含量（体积比）为：DNA模板10%，引物混合物10%，三蒸馏水30%，Taq酶预混液50%。在Mix引物中，蚊子、按蚊、人血和疟原虫引物的剂量比为1:1.75:3:5。该反应体系的最佳循环条件为：955s、6020s、7220s、4个循环。9415秒7220秒9个循环。9415秒，6820秒，7224秒，25次循环。723分。105min。疟原虫扩增产物的长度为662~717bp，人类血液为519bp，中华按蚊位于bp的432号，常见的蚊子在190~320 BP之间。对四名疟疾患者血液样本的优化多重PCR试验结果表明，该方法对间日疟患者血液样本的灵敏度最高，最低检测密度为10.7寄生虫/L血液，对间日疟原虫患者血液样本的灵敏度最低，最低疟原虫密度为133.3寄生虫/L血液。卵形疟疾和恶性疟疾患者血液样本的最低疟原虫密度分别为15.0和34.0寄生虫/L血液。平均敏感度为48.25寄生虫/L血液。对模拟危险感染阳性蚊子样本的检测结果表明，中华按蚊模拟阳性样本有4条带（662~717、519、432、190~320bp），人血摄入后中华按蚊样本有3条带（519、432、190~320bp），没有吸血或动物吸血的中华按蚊样品有两条带（432190~320bp），吸食人类血液的非中华按蚊样品有两条带（519190~320bp），不吸食血液或畜血血液的非中华按蚊样品有一条带（190~320 BP）。特异性试验结果显示，其他11种寄生虫的DNA样本呈阴性。对家畜围栏周围采集的野生中华按蚊样本和吸食人类血液的室内蚊子的检测结果表明，人类血液引物的特异性良好。结论本研究建立的疟蚊病媒多重PCR检测方法可同时获得蚊种鉴定、人类血液指数和疟原虫感染等多种信息。该方法灵敏度高，特异性好。